1 Se selecciono aprox. 40 g de hojas frescas de espinaca, se lavaron con agua de la llave, procurando que el agua no cayera directamente sobre las hojas se secaron con toallas de papel.
2. Se cortó el tallo, la nervadura principal y el ápice de cada hoja.
3. Se colocaron en un mortero previamente enfriado en hielo y se agregaron 100 ml de medio de aislamiento frío, homogenizo hasta obtener pedacitos muy pequeños de hoja de aprox. 3 Mm de diámetro.
4. Se filtro la suspensión usando 8 capas de gasa, se recogió el filtrado en dos tubos de centrífuga de 15 ml cada uno, previamente enfriados en hielo.
5. Se centrifugo por 5 min. a 4000 rpm, decanto el sobrenadante y desecho.
6.El sedimento se resuspendió con 2.0 ml de medio de aislamiento de cloroplastos.
10. Se tomo, con una pipeta Pasteur, una gota de la suspensión de cloroplastos y se observó al microscopio.
11. Se tomaron 0.5 ml de la suspensión de cloroplastos en un tubo de ensaye y se puso durante 10 min. en agua hirviendo “Suspensión de cloroplastos hervidos”, y se observó al microscopio.
B.Cuantificación de clorofila:
1.Para determinar la concentración de clorofila, se colocaron en dos tubos de centrifuga (tubos de vidrio) 5 ml de acetona al 80% y 20 µL de la suspensión de cloroplastos
2.Se cubrió con parafilm, los tubos, se agitaron bien e incubo el tubo en la obscuridad por 5 minutos.
3.Se centrifugaron los tubos a 5000 r.p.m. durante 5 minutos, y coloco el sobrenadante en tubos de espectrofotómetro.
4.Se leyó su absorbancia a 645 y 663 nm calibrando el cero de absorbancia con acetona al 80%
5.La clorofila total en µg/ml se calcula con la siguiente formula:
[Chl en μg] = [ 8.05(Abs663) + 20.29(Abs645)]5
La cuantificación se realizo por duplicado
C. Determinación de la reducción del DCPIP
1. Para determinar la reducción del DCPIP se prepararon 5 tubos de espectrofotómetro como se indica en la tabla siguiente:
Tubos de espectrofotómetro
1
2
3
4
5
Medio de reacción con
DCPIP (300 µM)
ml
0
3
3
3
3
Medio de reacción sin DCPIP
ml
3
0
0
0
0
Herbicida comercial
ml
0
0
0
50 µl
Suspensión de cloroplastos
ml
60 µg
0 µg
60 µg
60 µg
60 µg
2. Se colocaron los tubos en una gradilla de unicel
3. Se taparon los tubos con papel parafilm y mezclo su contenido invirtiéndolosuavemente.
4. Se tapo el tubo 4 con papel aluminio
5. Se midio inmediatamente la absorbancia de cada uno de los tubos a la longitudde onda de 660 nm de. Ajusto a cero con el tubo 1. Se anotaron los resultados tiempo cero.
6. Se colocaron todos los tubos frente a una lámpara de 150 watts a 10 cm de distancia durante 1 minuto y se tomo nuevamente lectura en el espectrofotómetro. Se repitió este proceso 4 veces más
7. Se hizo una gráfica de Absorbancia contra tiempo.
