Procedimiento:
Experimento 1 (control):
1. Se diluyeron 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada.
2. Se determino el pH de la solución repitiendo la medición dos veces (total tres) con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal.
3. Se adicionaron 5ml de glucosa al 10%, se agito y se midió el pH
4. Se determino el pH de la solución cada 5min (4 veces) y luego cada 10min (2 veces más).
Experimento 2 (dinitrofenol):
1. Se diluyeron 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada.
2. Se añadió por decantación 0.2 ml de la solución de dinitrofenol 40mmol/L, concentración final de 200 mol/L
3. Se determino el pH de la solución repitiendo la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal.
4. Se espero 5 minutos.
5. Se repitieron los pasos 3 y 4 del experimento control.
Experimento 3 (azida de sodio):
1. Se diluyeron 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada.
2. Se añadió por decantación 0.5 ml de la solución de azida de sodio 400mmol/L, concentración final de 5mmol/L. Se agito con cuidado.
3. Se determinó el pH de la solución repitiendo la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal.
4. Se espero por 5 minutos.
5. Se repitieron los pasos 3 y 4 del experimento control.
Experimento 4 (Reducción de MTT)
1. Se tomo 1.5 mililitros de las soluciones de levaduras de los experimentos 1, 2 y 3, 15 minutos después de haber adicionado los inhibidores y se coloco en un tubo eppendorf de 2 mL (Todo por duplicado).
2. Se agregaron a cada tubo 12µL de MTT (5mg/mL) e incubaron los tubos 20 minutos a 37°C.
3. Pasado el tiempo de incubación, se sacaron los tubos y se observo la coloración.
4. Se centrifugaron los tubos a 1200 rpm durante 3 min.
5. Se elimino el sobrenadante y se resuspendio en 1 mL de isopropanol-ácido.
6. Se leyeron las muestras a 570nm.
